中央民族大學再帕爾·阿不力孜教授團隊在《Acta Pharmaceutica Sinica B》上發表了一篇題為“In situ metabolomics in nephrotoxicity of aristolochic acids based on air flow-assisted desorption electrospray ionization mass spectrometry imaging”的研究論文，建立了一種基于空氣動力輔助離子化質譜成像技術（AFADESI-MSI）的原位代謝組學方法，用于研究馬兜鈴酸（AAs）引起的腎毒性，發現了與腎毒性有關的代謝產物并證明了該方法用于研究藥物毒性分子機制的可能性。

AAs具有抗病毒、抗菌和抗腫瘤等活性，但同時也具有腎毒性，目前與AAs相關的腎損傷和功能障礙的潛在機制仍不*清楚。之前已開發了基于LC-MS、GC-MS的代謝組學方法來研究AAs的腎毒性，但對它們在腎臟內的空間分布了解甚少。本論文采用基于AFADESI-MSI的原位代謝組學方法，將AFADESI與超高分辨率Q-OT-qIT質譜儀結合用于研究AAs引起的腎毒性作用，揭示AAs誘導的腎毒性背后的復雜病理過程。

1.樣品制備和生化分析

將大鼠隨機分為AAs致腎毒性組（n=6）和對照組（n=6），分別收集24h尿液樣品和血液樣品（血液樣品經離心后獲得血清）進行生化分析。隨后將大鼠處死速凍后，將腎臟切成10 μm的切片，并用H＆E染色以顯示組織病理學病變。

2.AFADESI-MSI分析和數據處理

采用AFADESI分析大鼠腎臟切片，以200 μm/s的恒定速率在x方向上連續掃描組織表面，并在y方向上間隔200 μm在正離子模式下采集數據，掃描范圍為m/z 100-1000，隨后使用Xcalibur軟件獲取數據導入MassImager中進行離子圖像重建，再采用Markerview™、SIMCA-P進行多變量統計分析（圖1）。

圖1

1.AFADESI-MSI條件的優化

通過分析同一大鼠腎臟的相鄰組織切片，研究質量分辨率對選擇性、靈敏度和空間分辨率的影響。結果如圖2所示，當分辨率從30000提高至240000時，可有效分離相差僅0.02 Da的信號，從而改善圖像的選擇性。但掃描速度隨分辨率的提高而降低，這可能會影響分析的靈敏度和空間分辨率。終選擇分辨率為120000，以在選擇性、靈敏度和空間分辨率之間取得良好的平衡。

圖2.大鼠腎臟中m/z接近的代謝物圖像

通過連續3天分析相鄰腎臟切片評估AFADESI-MSI方法的重現性。將9種代表性代謝物進行提取和比較，并計算皮質、外延髓和內延髓中這些代謝物相對強度的RSD以評估日內精密度。其中甜菜堿、甘油磷酸膽堿和PE（36：4）的重現性如圖3所示，結果發現大部分代謝物相對強度的RSD＜20％，這表明AFADESI-MSI可以可重現地提供半定量數據。

圖3. AFADESI-MSI方法的重現性

2.AAI治療大鼠的腎損傷評估

表1為體重和生化參數。結果表明，AAI治療大鼠的體重下降，尿蛋白（Upr）、尿蛋白-肌酐比（Upr/Ucr）和肌酐（Ucr）增加，這表明AAI引起了大鼠的腎毒性作用。此外在AAI治療組中血清甘油三酸酯增加，但兩組之間的血清膽固醇酯、血清HDL和血清LDL無明顯差異。

表1

圖4為腎臟組織的H＆E染色結果，發現AAI治療大鼠出現腫脹和形態變化，且皮質和延髓均出現壞死和炎性細胞浸潤。這些病理變化進一步表明AAI能引起大鼠快速進展性腎小管間質病變。

圖4.（A）對照和（B）AAI治療大鼠腎臟切片的H＆E染色結果

3.AFADESI-MSI分析

采用AFADESI-MSI在正離子模式下檢測對照組和AAI治療組的大鼠腎臟切片以研究AAI對大鼠腎臟的生物學效應。在腎皮質、外延髓和內延髓分別檢測到512、368和388個生物學信息峰。圖5為腎皮質、外延髓和內延髓的OPLS-DA散點圖，結果發現AFADESI-MSI可將對照組的三個區域清楚分開，但AAI治療組中的三個區域之間分離趨勢不明顯，可能是由于AAI對腎臟不同形態區域的代謝物具有組織特異性作用。

圖5.對照組（A）和AAI治療組（B）的OPLS-DA得分圖

隨后進行了一系列OPLS-DA分析，以進一步研究AAI對腎皮質、外延髓和內延髓的影響。結果如圖6所示，AAI治療后腎皮質的代謝組學改變比外延髓和內延髓的改變更明顯，這表明腎皮質比延髓更易受AAI影響。基于預測閾值>1.0和P<0.05的變量重要性，分別選擇了85、65和51個變量作為AAI誘導的腎皮質、外延髓和內延髓毒性的潛在生物標志物，然后通過MS/MS初步鑒定出38個差異代謝物（表2）。為進一步評估這些代謝物與AAI引起的腎毒性的關系，提取了這些代謝物的離子圖像，并與相鄰切片H＆E染色獲得的組織學特征進行比較。結果表明，這些代謝物的分布與組織病理學腎臟病變表現出良好的空間匹配性。

圖6.OPLS-DA分析

表2

4.討論

4.1 精氨酸-肌酸代謝途徑和尿素循環的改變

精氨酸、肌酐的增加表明AAI可導致精氨酸-肌酸代謝途徑上調，同時髓質中亞精胺濃度的增加也表明AAI可導致尿素循環代謝途徑的功能障礙，這與先前的研究發現一致（圖7）。

圖7.精氨酸肌酐代謝途徑中代謝物空間分布

4.2 膽堿代謝紊亂

在AAI治療大鼠的腎皮質和延髓中膽堿和甘油磷酸膽堿增加，而在腎外髓質中甜菜堿和脯氨酸甜菜堿降低，這表明在AAI治療的大鼠中有機離子轉運發生改變（圖8）。

圖8.膽堿代謝相關的代謝物的空間分布

4.3 脂質代謝紊亂

腎髓質中肉堿和棕櫚酰肉堿的濃度顯著增加，尤其是在AAI治療的大鼠的腎臟的近髓質皮層中（圖9）。肉堿的積累和亞油酰基肉堿的減少表明AAI會導致腎臟線粒體功能障礙，各種脂質的上調或下調也表明AAI可導致脂肪酸代謝紊亂。

圖9.脂質代謝相關的代謝產物的空間分布

4.4 對N-乙酰組胺、磷酸絲氨酸、肌苷和果糖基賴氨酸代謝的影響

N-乙酰組胺在腎臟近髓質皮層中上調，表明AAI可能引起了腎臟近髓質皮層的類過敏反應；近髓質皮層中磷酸絲氨酸的上調可能反映了絲氨酸合成的增加或腎臟過濾的改變；AAI治療可導致腎髓質中肌苷降低，肌苷是氧化應激的標記，表明AAI可能導致腎臟線粒體功能障礙和能量代謝的中斷；AAI治療大鼠中果糖基賴氨酸降低，可能反映了AAI治療的大鼠中腎臟轉運蛋白活性的改變（圖10）。

圖10. N-乙酰組胺、磷酸絲氨酸、肌苷和果糖基賴氨酸的空間分布

目前尚不清楚AAI治療大鼠腎臟組織中不同代謝物變化的潛在機制。但大多數代謝物含量和分布的變化似乎與線粒體功能障礙有關，可能是由于AAI暴露引起腎小管上皮細胞中的線粒體損傷，從而導致線粒體脂質代謝功能異常，能量代謝中斷，ATP依賴性腎臟轉運蛋白活性改變，細胞凋亡。此外在病變區域發現的大多數代謝產物為脂質，這表明脂質代謝產物可能成為AAs致腎毒性的生物標志物。

本研究開發了一種基于AFADESI-MSI的原位代謝組學方法用于研究由AAI引起的腎毒性的潛在分子機制，該方法能夠高通量和高分子特異性的可視化內源性代謝物的分布和變化，且無需標記和復雜的樣品預處理。結果發現在AAI治療的大鼠中有38種代謝物的分布發生了顯著變化。通過AFADESI-MSI分析獲得的分子圖像與組織學染色對比，有助于發現與藥物毒性密切相關的生物標志物。

Wang Z , He B , Liu Y , et al. In situ metabolomics in nephrotoxicity of aristolochic acids based on air flow-assisted desorption electrospray ionization mass spectrometry imaging[J]. Acta Pharmaceutica Sinica. B, 2020, 10(6).

AAs：Aristolochic acids，馬兜鈴酸；AFADESI-MSI：air flow-assisted desorption electrospray ionization mass spectrometry imaging，基于空氣動力輔助離子化的質譜成像技術；Upr：urine protein，尿蛋白（Upr）；Ucr：creatinine，肌酐。